鱟試驗(yàn)方法——用產(chǎn)色基質(zhì)法檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法

日本學(xué)者對(duì)內(nèi)毒素的產(chǎn)色基質(zhì)測(cè)定法（Chromogenic subs-trate method）進(jìn)行了大量的研究。從鱟試驗(yàn)的反應(yīng)機(jī)理可知，鱟試劑中含有一種特異的前凝固酶，其受內(nèi)毒素激活后變成有活性的凝固酶，后者具有α-凝血酶的活性及Xa因子及XⅡa因子的一些功能。這種酶可水解凝固蛋白原成三個(gè)片段，即A鏈、B鏈及C肽。A、B鏈和C肽再通過共價(jià)相聯(lián)而成為凝膠。此酶作用的部位，分別為A鏈羧基端的-Val-Leu-Gly-Arg（Gly，Arg 分別為第17、18位）及C肽的-Val- Ser-G1y-Arg（G1y，Arg分別為第45、46位）上，提示羧基末端Gly-Arg的結(jié)構(gòu)可受到鱟血凝固酶的作用。鑒于此，利用人工合成的肽-硝基苯胺.（肽一PNA）或肽-4甲基香-豆素酰胺（肽-MCA）基質(zhì)中肽段氨基酸排列順序與凝固蛋白質(zhì)切斷部位的氨基酸排列順序相同的特性，就可以由于這種酶的水解作用，使產(chǎn)色基質(zhì)游離出來，即可用分光光度計(jì)于適當(dāng)?shù)牟ㄩL處測(cè)得吸光度。

如用肽-PNA基質(zhì)，則釋出的為PNA，可在405nm處測(cè)定吸光值。如用肽-MCA基質(zhì)，即釋出7-氨基-4-甲基香-豆素（AMC）經(jīng)380nm波長紫外線激發(fā)后，在460nm處可測(cè)得熒光，如用370nm波長亦可測(cè)知AMC的游離量。

目前應(yīng)用的產(chǎn)色基質(zhì)有許多種，主要有:

Bz - lle - Glu - Gly -Arg - PNA

Bz - Val - Gly - Arg - PNA

Boc - Lue - Gly - Arg -PNA

Boc - Lue - Gly - Arg - PNA

Boc - Ser - Gly - Arg - PNA

Boc - Leu - Gly -Arg - MCA

Boc - Ser - Gly - Arg- MCA等。

這些基質(zhì)對(duì)鱟凝固酶的酰胺酶感性隨內(nèi)毒素濃度的提高和作用時(shí)間的延長而增強(qiáng)，顯示其高度的專一性。測(cè)出內(nèi)毒素的范圍為5Pg-50ng/ml。反應(yīng)時(shí)間延長測(cè)得更低的內(nèi)毒素值。反應(yīng)需要的最適pH為8.0～8.5。

在試驗(yàn)時(shí)必須作陽性標(biāo)準(zhǔn)管，即以一定濃度（如0.100，0.025，0.075ng/ml）的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素與肽-PNA或肽-MCA反應(yīng)，然后作出線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。作出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)應(yīng)＞0.98，變異系數(shù)＜5 %。被檢樣品的吸光值只要與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，即得知標(biāo)本中所含的內(nèi)毒素量。亦可采用下列公式求得如下圖:

如果要測(cè)定血漿或血清中的內(nèi)毒素，則由于其中含有內(nèi)毒素抑制蛋白，可事先加熱37℃30分鐘，以破壞這些抑制物質(zhì)，或通過稀釋的方法消去這些抑制物質(zhì)。亦可在血清中加入標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。